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公司新闻/正文
PCR 实验技术指南及问题排查
5307 人阅读发布时间：2025-08-05 18:14
PCR 实验技术指南
- 始终将 DNA 储存在 Tris-EDTA 缓冲液 (pH 8) 中，以防降解。
- 使用带滤芯的移液吸头，并戴上手套以避免（交叉）污染。
- 避免在通风的超净台中移取反应混合物，这会增大交叉污染的风险。
- 在分子生物学实验操作少的工作区域，进行反应物混合。
- 配置反应体系时，应在最后一步才加入DNA聚合酶。
- 避免反复解冻和重新冷冻核苷酸 (dNTP)，因为这样会破坏核苷酸。建议将核苷酸（和引物）分装并储存在 -70℃ 下。
- PCR 扩增时，每 1kb DNA 模板延伸时间是 1 分钟。
- 使用经认证为无 DNA、无 DNase/RNase 且无 PCR 抑制剂的耗材，并避免在使用前对耗材进行高压灭菌，该步骤会导致耗材被不明生物分子污染。
- 当 PCR 产物从凝胶中切出时，应尽可能缩短在紫外线下暴露的时间，以避免 DNA 序列突变出错。
DNA 模板使用指南
- 如需在 25 – 30 个循环中检测出 PCR 产物，大约需要 100 个模板拷贝。如果模板 DNA 的拷贝数少于 10 个，则至少需要 40 个循环。
- 经验法则：使用质粒 DNA 时需要 1pg – 1ng 的模板浓度，使用基因组 DNA 时需要 1ng – 1µg 的模板浓度。较高的模板浓度会降低反应的特异性，从而导致非特异性 PCR 产物增多。
- 通过光度计检查 DNA 模板的纯度（260 nm/280 nm 比值应大于或等于 1.8），以确保模板没有被 PCR 抑制剂污染，如果检测到污染，请使用 DNA 试剂盒纯化或进行乙醇沉淀， 去除 PCR 抑制剂。
- 必要时，使用凝胶电泳检查 DNA 模板是否降解。
引物使用指南
- 经验法则：每个引物使用 0.05 – 1 µM 的工作浓度。由于引物的非特异性结合，较高的引物浓度会导致非特异性 PCR 产物增多。在最终反应中，每个引物的浓度通常最好为 0.2 µM。
- 引物的长度最好控制在 20 到 30 个核苷酸之间。
- 引物的 GC 含量应在 40% 到 60% 之间，并且 GC 分子应在整个引物长度上均匀分布。为了优化 GC 含量较高的 PCR 产物的扩增，可以在反应混合物中加入 DMSO。使用 DMSO 等添加剂时，可能需要调整退火温度，因为高浓度会削弱引物结合，添加剂浓度不超过 10%。
- 上下游引物之间的退火温度 (Tm) 相差不应超过 5℃，且温度范围在 50℃ 至 72℃ 之间。
- 反应使用的退火温度应比 Tm 较低的引物的计算得出的 Tm 低 0 – 5℃。
PCR 实验问题排查
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问题
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可能的原因
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解决办法
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没有扩增产物
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反应体系中存在 PCR 抑制剂
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使用经认证为不含 DNA、不含 DNase/RNase 且不含 PCR 抑制剂的耗材。通过测定光度的方式检测 DNA 模板纯度，以确定模板是否被 PCR 抑制剂（苯.酚、蛋白酶 K、K+、Na+ 等）污染。如果 260 nm/280 nm 比值小于 1.8，请使用 DNA 纯化试剂盒或进行乙醇沉淀，以去除可能存在的 PCR 抑制剂。 稀释模板（以及 PCR 抑制剂），或者提高 DNA 聚合酶的浓度。
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PCR 模板降解
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使用凝胶电泳检查 PCR 模板是否出现了降解。如果发现初始 DNA 有降解的迹象（DNA 弥散、条带太小等），重新进行模板提取，在提取过程中尽量减少 DNA 剪切。将模板 DNA 储存在 Tris-EDTA 缓冲液 (pH 8) 中，以防止降解。
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反应条件需要优化
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可能是退火温度太高、变性时间太长或使用的循环次数太少。通过以 1-2℃ 的幅度逐渐降低退火温度进行优化，将 DNA 起始变性时间调整为 3 分钟（变性时间过长会使 DNA 降解），然后在反应循环期间变性 30 秒和/或增加 5 个循环。
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反应体系中遗漏某组分
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重新进行 PCR。
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非特异性扩增产物
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试剂污染（例如水）
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PCR 试剂（通常是使用的水）可能在之前的移液操作中被无意中污染，更换新的 PCR 试剂。
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反应条件需要优化
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可能是退火温度太低、使用的循环次数太多或延伸时间太长。退火温度太低会促进非特异性引物结合。利用温度梯度功能确定最佳退火温度。循环次数过多有时也会导致非特异性 PCR 产物的扩增。如果出现非特异性 PCR 产物，在试验的基础上减少 5 个循环。延伸时间过长也会促进非特异性扩增，根据 PCR 产物的
大小，使用尽可能精确的延伸时间（对于每 1 kb DNA 模板的扩增，Taq 聚合酶需要大约一分钟的延伸时间）。
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反应体系中 Mg2+ 过多
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过高的 Mg2+ 浓度会增加引物发生非特异性结合的可能性，从而形成不需要的 PCR 产物。在这种情况下，减少 Mg2+ 的使用量。
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PCR 模板降解
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使用凝胶电泳检查 PCR 模板是否出现了降解。如果发现初始DNA 有降解的迹象（DNA 弥散、条带太小等），重新进行模板提取，在提取过程中尽量减少 DNA 剪切。将模板 DNA 储存在Tris-EDTA 缓冲液 (pH 8) 中，以防止降解。
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